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細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)用試劑

更新時(shí)間:2016-01-20 點(diǎn)擊次數(shù):1513
 一、原理

    在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶,能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等, 能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑,可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下,能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的 形成。
  細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快,使之迅速通過細(xì)胞zui易受損的-5~0℃,細(xì)胞仍能生長(zhǎng),活力受損不大。
  目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對(duì)細(xì)胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。


二、操作步驟
(一)凍存
1、消化細(xì)胞(同實(shí)驗(yàn)二),將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),計(jì)數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴(yán),否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標(biāo)簽,寫明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘〕→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時(shí))→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。
  注意:操作時(shí)應(yīng)小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時(shí)補(bǔ)充,不能揮發(fā)干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
(二)復(fù)蘇
1、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞,內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3、打開凍存管,將細(xì)胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。
6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng),第二天觀察生長(zhǎng)情況。


三、試劑和器材
器材:液氮罐、凍存管(塑料螺口凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等
試劑:0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液)
附:凍存液配制:
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

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